medicina - medicine

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UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI ROMA

"LA SAPIENZA"

 

FACOLTA' DI SCIENZE STATISTICHE

 

Corso di laurea in:

SCIENZE STATISTICHE ED ECONOMICHE

 

 

 

PROCEDURE STATISTICHE

PER IL CONTROLLO E LA NORMALIZZAZIONE

DI MICROARRAY DI cDNA

 

 

Relatore:                                                                     Candidata:

Prof. Renato Coppi                                                     Sonia Eramo

                                                                                     Matricola:

                                                                                     04031392

 

Correlatore:

Prof. Agostino Di Ciaccio

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Anno Accademico 2003-2004

 

Seduta del 23 Maggio 2005


Indice

 

Introduzione.................................................................................................  pag.  4

 

Cap. I   L’informazione genetica e i microarray.......................................    pag.  5

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag.  5

2.      Il DNA.....................................................................................................  pag.  5

3.      La topoisomerasi......................................................................................  pag.  6

4.      Cosa sono i microarray............................................................................   pag.  7

5.      I campi di applicazione dei microarray....................................................     pag.  9

6.      Il disegno sperimentale............................................................................    pag.  9

6.1.      Campione di controllo.....................................................................   pag. 10

6.2.      Le repliche......................................................................................  pag. 10

6.3.      Unità sperimentali e assegnazioni dei trattamenti..........................        pag. 11

6.4.      Altre fasi dell’esperimento..............................................................    pag. 11

6.5.      Regole di confronto tra campioni...................................................     pag. 12

7.      Esperimento di microarray.......................................................................   pag. 13

7.1.      Il protocollo sperimentale...............................................................    pag. 13

7.2.      Esempio di esperimento di microarray di cDNA............................     pag. 14

7.3.      Costruzione di microarray di cDNA...............................................    pag. 15

7.4.      Estrazione ed etichettatura di campioni di RNA.............................     pag. 16

7.5.      L’ibridazione...................................................................................  pag. 17

7.6.      La scansione....................................................................................  pag. 18

8.      L’analisi dell’immagine...........................................................................     pag. 19

8.1.      La localizzazione e la segmentazione.............................................      pag. 19

8.2.      Estrazione dell’informazione..........................................................     pag. 20

8.2.1.      L’intensità dello spot, il foreground.......................................     pag. 21

8.2.2.      L’intensità di background......................................................    pag. 21

8.2.3.      Misure del cambio di espressione..........................................    pag. 21

 

Cap. II   I metodi  di pre-processing  e di normalizzazione.....................     pag. 23

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag. 23

2.      Le fonti degli errori sistematici................................................................     pag. 23

2.1.      Spatial effect...................................................................................   pag. 23

2.2.      Ibridazione irregolare......................................................................   pag. 23

2.3.      Printing tip......................................................................................   pag. 24

2.4.      Effetti causati dalle lastre e dai probe.............................................     pag. 24

2.5.      Effetto del gruppo di stampa e del disegno dell’array....................      pag. 24

2.6.      Dye effect........................................................................................  pag. 25

2.7.      Malfunzionamenti dello scanner.....................................................     pag. 25

2.8.      Effetto sperimentatore.....................................................................   pag. 25

3.      MA plot.................................................................................................... pag. 25

4.      I metodi di pre-processing.......................................................................   pag. 26

4.1.      Il valori mancanti............................................................................    pag. 26

4.2.      Sottrazione di background..............................................................   pag. 27

4.3.      Alcuni tipi di trasformazioni...........................................................     pag. 28

4.4.      Le repliche......................................................................................  pag. 29

4.5.      Media di repliche............................................................................   pag. 29

4.6.      Controllo della qualità delle repliche..............................................     pag. 30

4.6.1.      Repliche dei chip.................................................................  pag. 30

4.6.2.      Repliche di spot...................................................................  pag. 30

4.6.3.      Repliche “cattive”...............................................................   pag. 31

4.7.      Outlier.............................................................................................  pag. 31

4.8.      Filtro dei dati non attendibili...........................................................    pag. 32

4.9.      Filtro dei dati non interessanti.........................................................    pag. 33

4.10.  Statistiche semplici.........................................................................    pag. 33

4.10.1.  Media e mediana.................................................................  pag. 33

4.10.2.  Scarto quadratico medio.....................................................   pag. 33

4.10.3.  Varianza..............................................................................  pag. 33

4.10.4.  Asimmetria e normalità.......................................................    pag. 34

4.11.  Test Statistici...................................................................................  pag. 35

4.11.1.  T-test................................................................................... pag. 35

4.11.2.  Test dei segni......................................................................   pag. 36

4.11.3.  Analisi della varianza..........................................................    pag. 37

4.12.  Linearità..........................................................................................  pag. 38

5.      I metodi di normalizzazione.....................................................................    pag. 39

5.1.      Geni di controllo.............................................................................   pag. 40

5.2.      Normalizzazione globale e locale...................................................     pag. 41

5.3.      Scelta del metodo............................................................................  pag. 41

5.4.      Within-slide location normalization...............................................    pag. 41

5.4.1. Metodi di normalizzazione globale........................................     pag. 41

5.4.2. Metodi di normalizzazione locale..........................................     pag. 42

5.5.      Within-slide scale normalization....................................................      pag. 44

5.6.      Multiple-slide normalization...........................................................     pag. 44

5.7.      Paired-slide normalization..............................................................    pag. 46

6.      Alcune considerazioni..............................................................................   pag. 47

 

Cap. III   I dati e la strategia di analisi......................................................   pag. 49

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag. 49

2.      La strategia di analisi...............................................................................    pag. 49

3.      Descrizione dei dati..................................................................................   pag. 49

4.      Assunzione base.......................................................................................  pag. 53

5.      Dati validi.................................................................................................  pag. 53

6.      Variabili utilizzate nell’analisi.................................................................       pag. 55

 

Cap. IV   La qualità dei dati.......................................................................   pag. 56

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag. 56

2.      Foreground vs background......................................................................   pag. 56

3.      Rapporto del segnale di background........................................................   pag. 57

4.      Sottrazione di background.......................................................................   pag. 58

5.      Valori estremi...........................................................................................  pag. 60

6.      Conclusioni..............................................................................................   pag. 61

 

Cap. V   Identificazione dell’errore sistematico.......................................    pag. 63

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag. 63

2.      Struttura del microarray...........................................................................   pag. 63

3.      Le trasformazioni.....................................................................................   pag. 63

4.      Scelta delle variabili.................................................................................   pag. 63

5.      Analisi generale.......................................................................................    pag. 65

5.1.      Dati non trasformati........................................................................   pag. 65

5.2.      Trasformate logaritmiche................................................................    pag. 68

5.3.      Log Ratio........................................................................................  pag. 71

6.      Analisi per blocchi...................................................................................   pag. 72

6.1.      Dati non trasformati........................................................................   pag. 72

6.2.      Trasformate logaritmiche................................................................    pag. 74

6.3.      Log Ratio........................................................................................  pag. 75

6.3.1.      Test dei dati appaiati..............................................................   pag. 75

6.3.2.      Analisi della varianza.............................................................    pag. 76

6.3.3.      MA plot.................................................................................. pag. 77

7.      Conclusioni..............................................................................................   pag. 79

 

Cap. VI   La normalizzazione.....................................................................    pag. 80

 

1.      Introduzione.............................................................................................  pag. 80

2.      Metodi...................................................................................................... pag. 80

3.      Normalizzazione globale: median centering............................................       pag. 81

4.      Normalizzazione locale............................................................................    pag. 81

4.1 Subarraywise median centering.........................................................    pag. 81

4.2 Intensity dependent normalization.....................................................     pag. 81

4.3 Within-print-tip group-normalization: location.................................       pag. 82

4.4 Within-print-tip group-normalization: scale………………………..    pag. 83

5.      Confronto fra i metodi di normalizzazione..............................................      pag. 83

6.      Conclusioni..............................................................................................   pag. 89

 

Conclusioni...................................................................................................  pag. 90

 

Riferimenti bibliografici .............................................................................   pag. 95

 




 
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